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Intellectual disability (ID), one of the most complex disorders, has a worldwide prevalence of approximately 2% and is a frequent cause of severe disability. Therefore this disorder constitutes a major burden not only on the affected families but also on society. It has become clear that X-linked forms account for only ten percent of ID cases, which means that the vast majority of the underlying genetic defects must be autosomal, but it has so far received considerably less attention. A particularly straightforward strategy for the identification of genes underlying autosomal recessive disorders is homozygosity mapping in extended consanguineous families, followed by mutation screening of candidate genes. In Western societies, where most of the research takes place, its investigation has been hampered by infrequent parental consanguinity and small family sizes. Therefore, to unravel the molecular basis of ARID in a systematic fashion as a prerequisite for diagnosis, counselling and therapy, we focused on large consanguineous Iranian families with several mentally retarded children. During the course of our investigations into the autosomal recessive causes of intellectual disability (ARID,) we have identified numerous new loci for this condition. However, no more than six hotspot loci for unspecific or non-syndromic autosomal recessive intellectual disability (NS-ARID) have been identified, which may indicate that, at least in the Iranian population, not all of the gene defects causing NS-ARID are extremely rare and the possible existence of common molecular causes for NS-ARID have not been ruled out. The work presented here is part of this large project to shed more light on the molecular causes of ARID. In this study the investigation of two out of these 6 hot spot loci led to the identification of underlying gene defects. One of these involves the linkage intervals of two Iranian families with several NS-ARID patients overlapping on Chr19q13.2-q13.31. Two different missense mutations with high pathogenicity scores were detected in ZNF526, which encodes a krueppel-type zinc finger protein. One of these changes was observed in DNA samples collected from two distinct families with nonsyndromic ID, but closer inspection revealed that these families, which live in the same city in the Northwestern part of Iran, share a common haplotype and thus must be distantly related. Each mutation affects a functional domain of ZNF526 and both alter the protein conformation, causing a putative functional impairment as suggested by in silico protein modelling. A decrease in DNA affinity was confirmed by CHIP-seq, and array- based gene expression studies showed specific changes in the expression patterns of patient lymphoblastoid cells, which could be recapitulated in ZNF526-deficient neuroblastoma cells. Functional annotation showed significant enrichment of the deregulated genes in pathways that play a role in protein synthesis, mitochondrial dysfunction, energy metabolism and gene regulation. We could implicate that ZNF526 protein interacts with PRKRIR, which is a transcription factor (TF) that has been added to human TF repertoire recently in the primate history. Therefore ZNF526 and PRKRIR together are particularly promising candidates in investigating the development and evolution of higher brain function in primates. This study also resolved the underlying gene defect of MRT5 and reported three deleterious mutations in NSUN2. These were found in two independent consanguineous Iranian families and one Turkish family with several patients suffering from non-syndromic ARID. NSUN2 encodes a methyltransferase, which catalyzes the intron-dependent formation of 5- methylcytosine at C34 of tRNA-leu(CAA). Hence all mutations lead to a loss of NSUN2 protein function in homozygous mutation carriers and in all likelihood cause the patient phenotype. In order to gain further evidence for an involvement of NSUN2 in cognitive functions, we studied Drosophila mutants that lack the NSUN2 ortholog. These experiments revealed a marked learning impairment in mutant flies, which clearly underscores the relevance of NSUN2 in higher brain functions. Furthermore, this study was the first report on a mutation in patients with dysequilibrium syndrome that affects VLDLR exclusively, confirming the central role of the very low-density lipoprotein receptor in the aetiology of this condition. The mutations in this gene have been found to be associated with quadrupedal mobility in other families, but not in our patients. In summary, our results show that both NSUN2 and ZNF526 belong to the still few genes known to carry NS-ID-causing mutations in independent families, which suggests that defects in either gene belong to the more common causes of NS-ARID, at least in the Iranian population. Further studies are necessary to identify the disease causing mutations in the other 4 hot spot identified loci and to determine the contribution of the affected genes to the complex processes of human cognition. These studies will be greatly facilitated by exome enrichment and next generation sequencing (NGS), which have recently been introduced as a cost-effective and fast strategy for comprehensive mutation screening and disease-gene identification in the coding portion of the human genome.,Mentale Retardierung (MR), eine der komplexesten Erkrankungen, hat eine weltweite Prävalenz von etwa 2% und ist ein häufiger Grund schwerster Behinderung. Aus diesem Grund ist diese Erkrankung sowohl für die Familie als auch für die Gesellschaft eine enorme Belastung. Es hat sich gezeigt, dass genetische Defekte auf dem X-Chromosom nur für 10% aller Fälle von MR verantwortlich sind, daher muss die überwältigende Mehrheit der genetischen Defekte auf den Autosomen kodiert sein. Die Erforschung der autosomalen MR hat bislang jedoch wesentlich weniger Aufmerksamkeit erhalten. Die Strategie zur Identifizierung der an autosomal rezessiven Erbkrankheiten beteiligten Gene umfasst, Homozygosity Mapping, in großen blutsverwandten Familien mit anschließendem Sequenzieren der Kandidatengene um Mutationen aufzuspüren. In westlichen Gesellschaften, wo ein Großteil der Erforschung von MR stattfindet, ist diese Strategie aufgrund von kleinen Familien und seltener Blutsverwandtschaft der Eltern kaum einsetzbar. Um die molekularen Ursachen autosomal rezessiver MR (ARMR) systematisch zu entschlüsseln, um als Grundvoraussetzung für Diagnose, Beratung und Therapie zu dienen, haben wir den Fokus auf große, blutsverwandte iranische Familien gelegt. In unseren Forschungen zu den molekularen Ursachen von ARMR haben wir neue ARMR-Loci identifiziert, doch sind darunter sechs Hot Spot-Loci für unspezifische oder nicht syndromaleARMR(NS-ARMR). Daraus kann geschlossen werden, dass zumindest in der iranischen Bevölkerung nicht alle Gendefekte selten sind und dass die Möglichkeit gemeinsamer molekularer Ursachen von NS-ARMR nicht ausgeschlossen werden kann. Diese Arbeit ist Teil des großen Projekts die molekularen Ursachen von ARMR zu erforschen. Zwei der sechs Hot Spots für ARMR wurden untersucht und die zugrunde liegenden Gendefekte identifiziert. Die Kopplungsintervalle von zwei iranischen Familien mit mehreren von NS-ARMR betroffenen Patienten überlappen auf Chr19q13.2-q13.31. Im Gen ZNF526 wurden zwei Missense-Mutationen mit hoher Pathogenitätsvoraussage identifiziert. ZNF526 kodiert ein Krüppel-Zinkfinger-Protein. Eine dieser Mutationen wurde in einer weiteren Familie mit NS-ARMR identifiziert, die in der gleichen Stadt im Nordwesten des Irans wohnt. Weitere Analysen ergaben einen gemeinsamen Haplotyp beider Familien, die daher entfernt miteinander verwandt sein müssen. Beide Mutationen betreffen funktionelle Domänen von ZNF526. In silico- Proteinmodellierung zeigte eine Veränderung der Proteinkonformation, welche wahrscheinlich die Funktion des Proteins behindert. Eine Minderung der DNA- Affinität wurde anhand von Chip-seq bestätigt. Spezifische Veränderung des Genexpressionsmusters in Lymphoblasten der Patienten wurde anhand von Arrays gezeigt. Dieser Befund konnte in ZNF526-defizienten Neuroblastomzellen rekapituliert werden. Die Annotation der Genfunktionen zeigte eine Anreicherung der deregulierten Gene in Singal-und Stoffwechselwegen, die eine Rolle in der Proteinsynthese, mitochondrialer Dysfunktion, Energiemetabolismus und Genregulation spielen. Des Weiteren konnten wir die Interaktion von ZNF526 und PRKRIR zeigen, einem Transkriptionsfaktor, welcher sehr spät in der Primatenevolution entstand. Diese beiden Proteine sind daher sehr viel versprechende Kandidaten zur Erforschung der Entwicklung und Evolution höherer Gehirnfunktionen von Primaten. In dieser Arbeit haben wir auch die Gendefekte in MRT5 aufgedeckt und drei schädliche Mutationen in NSUN2 identifiziert. Diese Mutationen wurden in zwei nicht miteinander verwandten blutsverwandten iranischen Familien sowie in einer türkischen Familie identifiziert. Die Patienten leiden unter NS-ARMR. NSUN2 kodiert eine Methyltransferase, welche die vom Intron abhängige Bildung von 5-Methylcytosin an das C34 der tRNA- leu(CAA) katalysiert. Alle Mutationen führen zum Verlust der Proteinfunktion und verursachen mit allerWahrscheinlichkeit den Phänotyp der Patienten. Um weitere Beweise für die Beteiligung von NSUN2 an kognitiven Funktionen zu erhalten, wurden Drosophila-Mutaten untersucht, denen das NSUN2-Ortholog fehlt. Die Mutanten zeigten deutliche Behinderung des Lernens, was deutlich die Relevanz von NSUN2 für höhere Gehirnfunktionen betont. Des Weiteren konnte diese Studie erstmals Mutationen in VLDLR (very low-density lipoprotein receptor) in Patienten mit Dysäquilibrium-Syndrom identifizieren und die zentrale Rolle des Rezeptors in der Verursachung der Krankheit bestätigen. Mutationen in VLDLR wurden auch mit vierfüßiger Fortbewegung in einigen Familien assoziiert, die jedoch in unseren Patienten nicht vorhanden ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl NSUN2 als auch ZNF526 zu den wenigen Genen gehören, die NS-ARMR verursachende Mutationen in mehreren voneinander unabhängigen Familien tragen. Daraus lässt sich schließen, dass beide Gene zu den häufiger von Mutationen betroffenen Genen bei NS-ARMR gehören, zumindest in der iranischen Bevölkerung. Weiter Studien sind nötig, um die krankheitsverursachenden Mutationen in den anderen vier Hot Spots zu identifizieren und die Beteiligung der betroffenen Gene an der humanen Kognition zu erschließen. Diese Untersuchungen werden durch die Exom- Anreicherung und das Next Generation Sequencing (NGS) erleichtert, welche kürzlich als kosteneffiziente und schnelle Strategien für das Mutationsscreening und die Identifizierung von Krankheitsgenen in den kodierenden Regionen des humanen Genoms eingeführt wurden.,
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